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乳腺癌Her2FISH检测指南
文章作者:病理科   文章来源:科室动态   发布时间:2015-10-16 11:17:22

乳腺癌HER2 FISH检测指南(2014)概要

作者:《乳腺癌HER2检测指南(2014)》编写组

一、组织标本的制备

1.标本类型:(1)手术切除标本;(2)粗针穿刺活检标本;(3)麦默通活检标本。

2.标本固定:所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定(1 h)。固定时应将标本每隔510 mm切开,并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以6—72 h为宜。

3.固定液类型:4%中性(磷酸缓冲)甲醛固定液。

4.组织切片:(1)未染色的切片置于室温不宜超过6周,以防抗原丢失。(2)用于IHC染色者切片厚度以35μm为宜,ISH法以4—5μm为宜。(3)完成检测的切片,IHC和亮视野ISH可按常规长期保存,FISH结果应立即照相存档并于一20℃保存,建议至少保存3个月备查。(4)各种检测方法均应有HE染色切片作为对照。

二、染色要求与结果判读

建议使用我国食品药品监督管理总局认证的检测试剂盒,对自行组配的检测系统则必须经过严格的内、外部质量控制,建立完善的实验室标准操作程序(SOP),并与权威机构批准的检测试剂盒进行比对,以保证检测结果的可靠性。

三、FISH检测指南

FISH技术通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的探针信号,以获得细胞核内染色体(或染色体片段)上基因状态的信息。目前进行HER2基因状态检测的探针多为同时含有HER2基因和该基因所在的第17号染色体着丝粒(CEPl7)序列的双探针,也可采用仅含有HER2基因的单探针。

1.观察程序:应在低倍镜下观察整张FISH切片,初步判断检测质量以及是否存在HER2扩增的异质性。要求至少找到2个浸润癌区域,计数至少20个浸润癌细胞。也可以参照IHC切片先确定可能存在扩增的浸润癌区域,然后于100倍物镜下通过特异通道滤光片观察HER2CEPl7信号,并进行信号计数和比值计算。

2.结果判读及注意事项:应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚(DAPI)染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中的双色信号。在观察信号时,应根据情况随时调节显微镜的焦距,准确观察位于细胞核不同平面上的信号以免遗漏。判读标准(35):双探针ISH(1)HER2CEPl7比值≥20时,为HER2阳性;HER2CEPl7比值<20,但平均HER2拷贝数/细胞≥60时也为HER2阳性。扩增细胞应均质、连续,且占浸润癌的10%以上。需要注意的是对于HER2CEPl7比值≥20,但平均HER2拷贝数/细胞<40的病例是否应该视为ISH阳性目前尚存一定争议。建议对这部分病例在报告中加以备注,提示目前的认识争议,建议临床医师参考IHC检测结果并与患者进行必要的沟通。

(2)HER2CEPl7比值<20且平均HER2拷贝数/细胞<40时为HER2阴性。(3)HER2CEPl7比值<20且平均HER2拷贝数/细胞<60,但i>40时为HER2ISH结果不确

定。单探针1SH:肿瘤细胞平均HEt2拷贝数/细胞<40为无扩增;肿瘤细胞平均HER2拷贝数/细胞≥60为扩增。扩增细胞应均质、连续,且占浸润癌的10%以上。平均HER

拷贝数/细胞在46之间为不确定。若众多HER2信号连接成簇时可不计数,直接视为基因扩增。对于ISH结果不确定的病例.需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位分析者重新计数。如仍为临界值,则应行IHC检测(FISH前未行),也可以选取不同的组织块重新检测。建议在HER2FISH检测报告中包括如下内容:患者信息(包括姓名、性别、年龄、门诊/住院号)、送检医师姓名、送检日期、标本信息(包括病理号和蜡块号)、标本部位和类型、探针信息、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果(包括评估的细胞数量、平均HER2拷贝数/细胞、平均CEPl7拷贝数/细胞、平均HER2拷贝数/平均CEPl7拷贝数的比值)、检测结论(如阳性、不确定、阴性、无法判读)

3.质量控制:(1)内对照:使用上述同时含有HER2基因和CEPl7序列的混合探针时,组织中≥75%的细胞核显示出双色信号时视为杂交成功,并且双色信号互为对照,癌与非癌细胞互为对照。出现下列情况时应视为FISH检测失败,包括:①对照样本未出现预期结果;②浸润癌病灶太小,难以观察到两个浸润癌区域并计数;③可计数信号的细胞<75%;④>10%的荧光信号位于细胞核外;⑤细胞核结构难以分辨;⑥有强的自发荧光。(2)外对照:应选择已知FISH阳性和阴性的标本片(或采用厂家提供的对照片)作为外对照,且杂交染色结果与预期相符。(3)如有可能,建议设置低扩增对照。

4.关于第17号染色体数目:FISH双探针检测中加入CEPl7探针的目的是为了在检测HER2基因的同时检测第17号染色体数目,从而将第17号染色体的非整倍体和单纯的HER2基因扩增,尤其是低水平的扩增区分开。但近年来的研究显示整条第17号染色体的多体罕见,CEPl7的多体并不能代表整条第17号染色体多体¨4。“。部分乳腺癌中第17号染色体存在HER2基因和着丝粒的共同扩增。1…。越来越多的学者认为,与HER2CEPl7比值相比,HER2拷贝数对于HER2基因扩增的判断更为重要Ⅲo。因此在HER2 FISH检测结果中除报告HER2CEPl7比值外,还应分别报告HER2拷贝数和CEPl7的数值。 

5.关于HER2基因的异质性:浸润性乳腺癌中HER2表达或扩增可存在异质性。虽然HER2基因异质性的临床意义目前仍不明确,但它可导致IHCISH检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致。1“”1。在ISH计数之前,应观察整张切片或使用IHC确定可能存在HER2扩增的区域。需要强调的是,即使存在异质性,但只要扩增细胞连续、均质,且占浸润癌lO%以上,就应明确报告为ISH阳性。可补充报告不同细胞群(>10)的计数值(包括计数的细胞总数、HER2拷贝数、CEPl7数值、HER2CEPl7比值),并报告扩增细胞群占所有浸润癌细胞的比例。

HER2双探针原位杂交检测判读结果